4. ULUSLARARASI AZERBAYCAN YAŞAM, MÜHENDİSLİK VE UYGULAMALI BİLİMLER KONGRESİ 15-18 EYLÜL 2023 ONLINE VE KİŞİSEL KATILIM BAKÜ, AZERBAYCAN

KONGRE ID

KONGRE ADI

4. ULUSLARARASI AZERBAYCAN YAŞAM, MÜHENDİSLİK VE UYGULAMALI BİLİMLER KONGRESİ

TARİH VE YER

15-18 EYLÜL 2023

ONLINE VE ŞAHIS KATILIM (BAKÜ, AZERBAYCAN) (13 FARKLI ÜLKEDEN)Azerbaycan, Amerika Birleşik Devletleri, Nijerya, Pakistan, Hindistan, Fas, Filipinler, Kosova,

Portekiz, Macaristan, Katar, Türkiye, Etiyopya

DÜZENLEYİCİLER VE KATILIMCI KURUMLAR

BZT Akademi, TürkiyeAzerbaycan Diller Üniversitesi, AzerbaycanPorto Yüksek Mühendislik Enstitüsü, Portekiz Bharathidasan Üniversitesi, HindistanTürk Kültürü ve Mirası Vakfı Başkanı, Azerbaycan Azerbaycan Başkanlığı HSDM Şube Müdürü, Azerbaycan Bakü Uluslararası Çokkültürlülük Merkezi, Azerbaycan

Organizasyon Komitesi Başkanları

PROF. DR. KAMAL MEHDİ OĞLU ABDULLAYEV / Rektör

Bilim Kurulu Başkanı

PROF. DR. İBRAHİM KAZIMBULLYLİ

Koordinatörler Başkanı / Genel Koordinatör

Dr. Baha Ahmet YILMAZ

KABUL EDİLEN BELGELER

27 Türk Katılımcı36 Yabancı Katılımcı %54 Yabancı Katılımcı Oranı %46 Türk Katılımcı Oranı

REDDEDİLEN BELGELER

2 Türk Katılımcı

DEĞERLENDİRME SÜRECİ

Tüm Başvurular Çift-Kör Hakem Değerlendirme Sürecinden Geçmiştir. Eserlerin Tüm Sorumluluğu Yazarına Aittir.

İNSAN KOLON KANSERİNDE MESOBUTHUS EUPEUS AKREP ZEHİRİNİN GEN VE PROTEİN İFADESİNDEKİ DEĞİŞİKLİKLERİN İNCELENMESİ

Havva Nur CANAK*, Özgün SİPAHİOĞLU, Serdar KARAKURT

Fen Fakültesi, Biyokimya Bölümü, Selçuk Üniversitesi, Konya, Türkiye

ORCID Kodu: 0009-0005-4453-6936 0000-0001-7160-8775 0000-0002-4449-6103

SOYUT

Genetik faktörlerin yanı sıra çevresel ilişkiler sonucu da ortaya çıkan kolon kanseri dünyada üçüncü sırada yer alıyor. Farklı tedavi yöntemleri kullanılabilir ancak bu yöntemler yalnızca sağlıklı hücrelere zarar vermekle kalmaz, aynı zamanda bireyi fiziksel ve psikolojik olarak yıpratır. Bu nedenle son dönemde alternatif tedavi yöntemi olarak doğal ilaç kaynağı olarak görülen akrep zehiri üzerinde çalışmalar yapılmaktadır. Bu çalışmada Buthidae familyasına ait Mesobuthus eupeus akrep zehirinin (MEV) insan kolon kanseri hücre hatlarında gen ve protein ekspresyonları üzerine etkileri araştırıldı. DLD-1 ve HT-29 hücreleri sırasıyla RPMI-1640 ve McCoy's5A büyüme ortamında büyütüldü. İn vitro qRT-PCR için trizol yöntemiyle RNA izolasyonu ve western blot için RIPA tamponu ile protein izolasyonu yapıldı. Her iki hücre hattında BcL-2, BAX, NF-ĸB, TP53, Kaspaz-3, Kaspaz-9, Kaspaz-12, BRAF, KRAS, Smad-4, MLH-1 ve APC genlerindeki mRNA düzeyindeki değişiklikler şu şekilde belirlenir: qRT-PCR yöntemi. Protein düzeyindeki değişiklikler için BcL-2, BAX, NF-ĸB ve TP53 proteinleri kullanılarak Western blot çalışmaları yapıldı. QRT-PCR çalışmalarında kontrol grubuyla karşılaştırıldığında; DLD-1 hücre hattında BcL-2, BAX, Braf ve APC genlerinin ekspresyon seviyeleri azalırken, HT-29 hücre hattında NF-ĸB ve Caspase-12 ekspresyon seviyeleri azaldı. Protein ekspresyonu sonucunda her iki hücre hattında da BcL-2 ekspresyonu azalırken, TP53 ekspresyon düzeyi DLD-1'de azalırken, HT-29'da da arttı. BAX ekspresyon düzeyi DLD-1'de arttı, HT-29'da ise azaldı. Çalışma sonucunda MEV hücre hatlarında gen ve protein ekspresyon düzeylerindeki değişikliklerin apoptozu desteklediği görüldü. Sonuç olarak MEV'in kolon kanseri tedavisinde alternatif bir terapötik ajan olarak kullanılabileceği öngörülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Apoptoz, Kolon kanseri, Mesobuthus eupeus , Akrep zehiri, qRT-PCR, Western blot. GİRİİŞ

Hücrelerin kontrolsüz çoğalması, yayılması ve metastaz yapması sonucu ortaya çıkan kanser, kalp-damar hastalıkları sonrasında ortaya çıkan önemli bir sağlık sorunudur. Farklı kanser türleri ortaya çıkıyor

genetik, çevresel, davranışsal ve biyolojik faktörlerin etkisi altında kadınlarda ve erkeklerde görülür. (Forman ve diğerleri, 2014). Kolon kanseri, kadınlarda ve erkeklerde kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedenidir. (Wild, Stewart ve ark. 2014). Genetik faktörlerin yanı sıra düşük lifli ve yüksek yağlı beslenme veya işlenmiş et tüketimi, alkol ve sigara kullanımı da kolon kanserinin nedenleri arasındadır. Tedavi yöntemi olarak kemoterapi, cerrahi ve radyoterapi gibi geleneksel yöntemler kullanılmaktadır. Ancak bu tedavi yöntemleri hem yetersizdir hem de istenmeyen yan etkilere neden olmaktadır. (Qureshi ve diğerleri, 2018). Bu nedenle alternatif tedavi yöntemleri aranmıştır. Bu alternatif tedavi yöntemlerinden elde edilen aktif bileşikler dahildir. Günümüzde hayvanlardan elde edilen aktif bileşiklerin, özellikle de yılan ve akrep zehirlerinin kanser tedavisindeki rolü üzerine çalışmalar yapılıyor. Akrep zehirlerinin yapısında bulunan çeşitli biyoaktif bileşikler, peptitler ve proteinler, bunların kanser başta olmak üzere birçok hastalığa karşı etkili tedavi yöntemi olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Aynı zamanda akrep zehirleri, hücre çoğalmasının ve hücrelerin depolanmasının engellenmesinden apoptozun uyarılmasına ve hücre göçü ve istilasının azaltılmasına kadar değişen antikanser aktivitelerine sahip olacak şekilde programlanmıştır (Ding ve diğerleri, 2014). Literatürdeki çalışmalara bakıldığında akrep zehirlerinin toplam etkilerini ya da birkaç aktif bileşenin çeşitli kanser türleri üzerindeki sitotoksik etkilerini inceleyen çalışmalara rastlamakla birlikte, moleküler mekanizmaları açıklayan çalışmaların da yapıldığı görülmektedir. hem gen hem de protein seviyeleri oldukça sınırlıdır. Bu çalışmada doğu sarı akrep olarak bilinen Buthidae familyasına ait Mesobuthus eupeus akrep türünün zehri kullanıldı. Bu akrep türü Türkiye'de Güneydoğu Anadolu'da bulunsa da Suriye, İran gibi bölgelerde de bulunmaktadır. Bu akreplerin vücutları sarı-kahverengidir; bacaklar açık sarımsı kahverengidir. Uzunlukları 3,5-5,0 cm arasındadır. Sırtlarındaki kabuk kısımları siyahımsı kahverengidir ve beş (5) çizgiye sahiptir (Kovařík ve diğerleri, 2011). Bu çalışmada daha önce kansere moleküler etkisi belirlenemeyen akrep türü Mesobuthus eupeus'un insan kolon kanseri üzerindeki etkileri moleküler düzeyde aydınlatılmaya çalışıldı.

MALZEMELER VE YÖNTEMLER

1. Büyüyen Hücre Hatları

Kolon kanseri hücre çizgileri DLD-1 ve HT-29 hücre çizgileri, sırasıyla RPMI-1640 ve McCoy 5A Ortamında %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 2 mM L-glutamin içeren büyüme ortamında, 37 ° içeren bir inkübatörde büyütüldü. C ve %5 CO2.

2. Kolon Kanseri Yolunda Anahtar Rol Oynayan Genlerin Ekspresyonundaki Değişikliklerin qRT-PCR Yöntemiyle Belirlenmesi

2.1. Toplam RNA İzolasyonu

Hücre hatlarından elde edilen örneklerden toplam RNA, trizol yöntemiyle izole edildi. Hücreler 24 oyuklu plakalarda büyütüldü ve 1 mL Trizol ile işlendi ve 1.5 mL eppendorf tüplerine aktarıldı. Daha sonra tüm numuneler 250 µL kloroform eklenerek santrifüj edildi. Elde edilen şeffaf sıvı faz alınarak izopropanol ilave edildi ve tekrar santrifüj edildi. RNA çökeltildikten sonra %75 soğutulmuş etanol yardımıyla RNA temizlendi. Etanol uzaklaştırıldıktan sonra RNA oda sıcaklığında kurutuldu ve ddH2O eklenerek çözünür forma dönüştürüldü. Şablon RNA'nın miktarı, bütünlüğü ve saflığı Agilent 2100 model Bioanalyzer yardımıyla ölçüldü. Numuneler daha sonraki çalışmalarda kullanılmak üzere -80°C'de saklandı.

2.2. cDNA sentezi

cDNA, 18-nükleotid uzunluğunda oligo d(T) primeri ve Moloney-Murin Lösemi Virüsü Ters Transkriptazı kullanılarak elde edilen RNA'lardan sentezlendi. CDNA sentezi için 2 ng toplam RNA ve 1

μL oligo (dT) primer karıştırıldı ve son hacim RNAse içermeyen su ile 11 μL’ye tamamlandı. Karışım 70oC’de 5 dakika inkübe edildikten sonra 5X reaksiyon tamponu ve dNTP karışımı ilave edildi. 37°C’de 5 dakika inkübasyonun ardından 50 ünite Moloney-Murine Lösemi Virüsü Ters Transkriptaz eklendi ve son hacim 20 µl’ye tamamlandı. Enzim ilave edildikten sonra son karışım cDNA sentezi için öncelikle 42°C'de 1 saat inkübe edildi ve bu sürenin sonunda enzimin inhibe edilmesi için 70°C'de 10 dakika bekletildi. Elde edilen cDNA miktarı Nanodrop cihazında ölçüldü ve kontrol edildi. cDNA'lar sonraki çalışmalarda kullanılmak üzere -20°C'de saklandı.

2.3. Kolon Kanseri Moleküler Yolunda Rol Oynayan Genlerin mRNA Düzeyinde Ekspresyonunun Belirlenmesi

Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR, Bio-Rad CFX96 cihazı (Bio-Rad, ABD) kullanılarak yapıldı. Reaksiyon, 1X Maxima® SYBR Green qPCR Master karışımı ile gerçekleştirildi. Reaksiyon tüpüne cDNA, RNase içermeyen su, gene spesifik primer, SYBR green qRT-PCR karışımı eklendi. GAPDH dahili standart gen olarak kullanıldı. QRT-PCR'de kullanılacak primerler Primer 3 yazılımı kullanılarak tasarlandı ve gen özgüllüğü NCBI blast yazılımıyla kontrol edildi. Daha sonra reaksiyon karışımı (tüp) PCR işlemi için öncelikle 95oC'de 10 dakika denatürasyona tabi tutuldu ve amplifikasyon işlemi 95oC'de 20 saniye, 54-60oC'de 30 saniye olmak üzere toplam 45 döngü sonrasında gerçekleştirildi, 72oC'de 30 saniye, 49oC'de ise 30 saniyelik son uzatma ile gerçekleştirildi. Gen ifadelerindeki değişiklik, spesifik gen mRNA ifadelerinin GAPDH mRNA ifadesine oranı hesaplanarak bulundu.

3. Kolon Kanseri Yolunda Anahtar Rol Oynayan Proteinler ve Apoptoz Yolunda Rol Oynayan Proteinlerin Ekspresyon Değişikliklerinin Western Blot Metodu ile Belirlenmesi

3.1. Protein İfade Çalışmaları

100 mm3'lük petri kaplarına 3x105 hücre olacak şekilde ekilen hücreler, akrep zehiri ile muamele edilerek 37 °C ve %5 CO2'de 48 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonunda hücreler 3 kez soğuk PBS ile yıkandı ve hücreler kazıyıcı yardımıyla mekanik olarak kazındıktan sonra soğuk PBS ilave edildi ve hücreler santrifüj edilerek çöktürüldü. Hücreler çöktürüldükten sonra süpernatan atıldı ve her bir eppendorf tüpüne ripa tampon karışımı ilave edildi ve 5 dakika buz üzerinde inkübe edildi. 14000 g'de 10 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatan temiz 1,5 ml'lik santrifüj tüplerine aktarıldı. Elde edilen proteinler daha sonraki çalışmalarda kullanılmak üzere -80 oC derin dondurucuda saklandı. Elde edilen proteinlerin konsantrasyonunu belirlemek için standart olarak kullanılan BSA (sığır serum albümini) ile 50:1 oranında seyreltilmiş protein fraksiyonları tüplere eklendi ve seyreltilmiş protein fraksiyonlarından 200 µL tüplere eklendi. Spektrofotometrede multiplate okuyucu ile üzerine 25 μL örnek eklenerek 660 nm’de ölçümler alındı.

3.2. Akrep Zehirinin Protein İfadesi Üzerindeki Etkilerinin Belirlenmesi

Akrep zehirinin kolon kanseri oluşumunda aktif rol oynayan genler üzerindeki etkileri belirlendikten sonra bu genlerin kodladığı proteinlerin ekspresyonuna olan etkileri vertikal elektroforez tekniği uygulanarak western blot yöntemiyle belirlendi. Proteinler SDS-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemiyle birbirinden ayrıldıktan sonra proteine özgü proteinler kullanılarak protein ekspresyonlarındaki farklılıklar belirlendi. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), iyonik deterjan sodyum dodesil sülfatın (SDS) varlığıyla tanımlanan bir toplu tampon sisteminde %8.5 ayırma ve %4 sıkıştırma jelleri üzerinde gerçekleştirildi.

Ayırma jelinin üzerine taraklar yerleştirildi. Kuyucuklar oluşturulduktan sonra kuyucuklara proteinler ve işaretleyiciler yüklendi. Jeller hazırlandıktan sonra uygulama için elektroforez yapıldı. SDS-PAGE işleminin ardından proteinler 25 voltta 30 dakika elektroforetik olarak aktarıldı. Aktarım tamamlandıktan sonra membrana aktarılan proteinler çalkalayıcıda blok solüsyon olan TBST ile 15 dakika çalkalandı. Süre sonunda membranlar bloklama solüsyonu ile 1 saat çalkalanmaya bırakıldı. 1 saat sonra membranlar ilgili primer antikorlarla 15 dakika çalkalandı ve primer antikorlarda gece boyunca inkübe edildi. İnkübasyon sonunda membranlar ilgili sekonder antikorlarla 1 saat çalkalanmaya bırakıldı. Çalkalamanın ardından membranlar TBST ile yıkandı. Daha sonra ECL solüsyonları hazırlanarak membranlara eklendi ve görüntüleme yapıldı.

SONUÇLAR

1. Gen İfadesi Sonuçları

Mesobuthus eupues akrep zehirinin kolon kanseri hücre hatlarında apoptoz ve kanser sinyal yollarında görev alan genlerin ekspresyonuna etkisini belirlemek amacıyla qRT-PCR ile gen ekspresyon çalışması yapılmıştır. Bu genler apoptotik genler (BAX, BCL-2, Kaspaz 3, Kaspaz 9 ve Kaspaz 12), apoptozla ilgili genler (NF-ĸB, TP53) ve kanser sinyal yolaklarında rol alan genler (Braf, Kras, Smad -4, APC, MLH-1) genleri incelendi. . Bu çalışma sonucunda Mesobuthus eupues'un kontrol grubuna göre HT-29 hücre hattında gen ekspresyon düzeylerinde değişikliklere neden olduğu gözlendi (Şekil 1).

Şekil 1 HT-29 hücre hattında apoptotik genlerin, apoptozla ilgili genlerin ve kanser sinyal yollarında yer alan genlerin ekspresyon seviyelerindeki değişikliklerin grafiği

2. Protein İfade Çalışmaları

Mesobuthus eupues akrep zehrinin kolon kanseri hücre hatlarında apoptozis yolunda yer alan proteinlerin ifadesinde neden olduğu değişiklikler western blot deneyi ile belirlendi. Elde edilen bant yoğunlukları imageJ yazılımı ile hesaplandı. DLD-1 hücre hattında BAX, NF-ĸB, MLH-1 proteinlerinin ifade düzeyleri sırasıyla 1,39; 3,50; %2,30 artarken; BCL-2 ve p53 proteinlerinin düzeyleri sırasıyla 0,74 ve 0,54 azaldı (Şekil 2).

Şekil 2 DLD-1 hücre hattında Mesobuthus eupues akrep zehirinin referans proteini GAPDH'ye karşı ekspresyon seviyelerinin grafiği

TARTIŞMA

Son yıllarda görülme sıklığı ve ölüm oranı hızla artan kanser; yaş, cinsiyet ve genetik faktörlerin yanı sıra sigara ve alkol gibi davranış bozuklukları sonucu da ortaya çıkar. Bu faktörlerle birlikte tümör baskılayıcı genlerde ve onkogenlerde mutasyonlar meydana gelir. Tedavi yöntemi olarak kullanılan kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi işlemler yetersizdir. Bu nedenle alternatif bir tedavi yöntemi aranmıştır. Günümüzde alternatif yöntemler ve çeşitli biyoaktif bileşikler, peptitler ve proteinler içeren akrep zehirleri üzerinde araştırmalar yapılmaktadır. Literatürde Salem ve ark. 2016 yılında yapılan bir çalışmada Buthidae familyasında yer alan Androctonus amoreuxi ve Androctonus crassicauda'dan elde edilen zehiri insan meme kanseri MCF-7 hücre hattına vererek bu zehirlerin kanser hücrelerindeki toksisitesini ve kanser hücrelerini yok etme yeteneklerini incelediler. nekrozu veya apoptozu indükler. Bu zehirlerin apoptozda rol oynayan kaspaz-3 ekspresyonunu arttırdığı bulunmuştur (Salem ve ark., 2016). Çalışmamız sonucunda HT-29 hücre hattında apoptozu teşvik eden Bax'in ekspresyon düzeyinin arttığı, BcL-2'nin ekspresyon düzeyinin ise azaldığı görüldü. Bu değişiklikler kaspazlardaki değişikliklerle kanıtlanmıştır ve zehrin apoptozu teşvik ettiği gözlemlenmiştir. Ayrıca SMAD-4 ve MLH-1'in rol oynadığı TGFβ sinyal yolunda toksik değişikliklere neden olarak hücrelerin metastazı ve çoğalmasını teşvik etti. Her ikisinin de ekspresyonu HT-29 hücre hattında artar (Chaudhury ve diğerleri, 2009). Kolon kanserinde önemli rolü olan ve hücre farklılaşmasında rol oynayan APC'nin ekspresyon düzeyi arttı. (Van den Broek ve diğerleri, 2016). Bir tümör baskılayıcı gen olan TP53, metastazdaki genlerin transkripsiyonunu kontrol ettiği için kanserde temel bir rol oynar. (Toyooka ve diğerleri, 2003). Bağışıklık sisteminde rol oynayan NF-κB.'nin ekspresyon düzeyleri de incelenmiştir (Barkett ve ark. 1999). Bu iki genin ekspresyonu HT-29'da azaldı. Aynı zamanda büyüme sinyallerinden bağımsız olabilmek için EGFR gibi büyüme faktörlerinin aktivasyonu önemlidir. Çünkü bu aktivasyon sonucunda tümör hücreleri çoğalıp hayatta kalabilmektedir. Bu sinyal yolunda rol oynayan BRAF ve KRAS genlerinin ekspresyonunun artması bu durumun önüne geçmektedir (Gurdal ve ark., 2019). Çalışmada kullandığımız zehir sayesinde HT-29 hücre hattında her iki genin de düzeylerinin arttığı tespit edildi. Bax, NF-Κb, BcL-2 ve p53'ün protein ekspresyonlarındaki değişiklikler de Western blot yöntemiyle incelendi. DLD-1 hücre hattında Bax ve NF-κB'nin ekspresyon düzeyi. kontrol grubuna göre artmış ve BcL-2 ve p53 ekspresyon düzeyi azalmıştır.

Literatürdeki bu çalışmaların sonuçlarına bakıldığında ve literatürdeki deneysel çalışmaların uygunluğu dikkate alındığında Mesobuthus eupeus akrep zehirinin kolon kanseri tedavisinde umut verici bir ilaç adayı olabileceği düşünülmektedir.

ÇÖZÜM

Mesobuthus eupeus akrep zehiri ile kolon kanseri hücre hatları üzerinde yapılan gen ve protein çalışmaları sonucunda zehirin apoptozu teşvik ettiği ekspresyon seviyelerinde değişiklikler gözlemlenmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda Mesobuthus eupeus akrep zehirinin kolon kanseri hücre hattına göre alternatif tedavi yöntemi olarak kullanılabileceği düşünülmektedir.

TEŞEKKÜRLER

Bu çalışma TÜBİTAK tarafından desteklenmiştir. (Proje No:120Z942). TÜBİTAK'a teşekkür ediyoruz.

REFERANSLAR

Barkett, M. ve TD Gilmore 1999. Apoptozun Rel/NF-κB transkripsiyon faktörleriyle kontrolü. Onkogen 18(49): 6910-6924.

Chaudhury, A. ve PH Howe 2009. Büyüme faktörü-beta (TGFβ) sinyalini dönüştürmenin hikayesi: Soigné bir gizem. IUBMB ömrü 61(10): 929-939.

Ding, J., ve diğerleri, 2014. Yeni kanser tedavi edici bileşiklerin potansiyel kaynağı olarak akrep zehirleri. Deneysel biyoloji ve tıp 239(4): 387-393.

Forman, D., ve diğerleri, 2014. Küresel ve bölgesel kanser yükü. Dünya kanser raporu 2014: 16-53.

Gurdal, H., ve diğerleri, 2019. Setuksimabın üçlü negatif meme kanseri hücre hatlarında epidermal büyüme faktörü reseptörü ve Src kinaz aktivasyonu üzerindeki kısmi agonistik etkisi. Uluslararası onkoloji dergisi 54(4): 1345-1356.

Kovařík, F., ve diğerleri, 2011. Türkiye'deki Mesobuthus eupeus'un (CL Koch, 1839) iki alt türü (Scorpiones: But-hidae) üzerinde. Euscorpius 2011(109): 1-15.

Qureshı, UF, ve diğerleri, 2018. “Kolorektal kansere karşı profilaksi olarak aspirinin rolü.” Pakistan Lisansüstü Tıp Dergisi 29(1): 16-19.

Toyooka, S., ve diğerleri, 2003. TP53 geni, tütüne maruz kalma ve akciğer kanseri. İnsan mutasyonu 21(3): 229-239.

van den Broek, E., ve diğerleri, 2016. Evre II ve III kolon kanserlerinin genomik profili, evre III kolon kanseri hastalarında hayatta kalma ile ilişkili olan APC mutasyonlarını ortaya koymaktadır. Hedefe uygun 7(45): 73876.

Vahşi, CP ve ark. 2014. Dünya kanser raporu 2014, Dünya Sağlık Örgütü Cenevre, İsviçre.